猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒

发布时间：2014-01-23 13:59:21

用途

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测试剂盒，用于检测疑似感染动物的血清或组织中的PRRSV，适用于PRRSV的检测、诊断和流行病学调查。

原理

利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以 RNA为模板，引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在 TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异 DNA片段的拷贝数放大一倍。经过 35次循环，最终使扩增 DNA片段放大了数百万倍。将扩增 DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到 DNA片段的扩增带。

试剂盒组成

*洗液Ⅰ首次使用前，请添加2.5ml（10头份）/5ml（20头份）100%乙醇。

*洗液Ⅱ首次使用前，请添加7ml（10头份）/14ml（20头份）100%乙醇。

需要自备的器材及试剂

器材：PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪、可调移液器（2.5µl、10µl、200µl、1000µl）、离心机、微波炉、一次性RNase Free吸头（10µl、200µl、1000µl）、RNase Free 1.5ml离心管、0.2mlPCR管。

试剂：琼脂糖、Marker、核酸染色液、TAE电泳缓冲液、PBS液（0.01M,pH7.2-7.4）。

使用注意事项

所有接触病料的物品均应合理处理，以免造成人员伤害及污染实验室。

所有试剂应在规定的温度储藏，-20℃保存的各试剂使用前应放于室温完全融化，使用后立即放回-20℃。

严格遵守操作说明可以获得良好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在3次内用完，请严格按照试剂盒说明书操作。

样品制备

       1样品采集：病死或扑杀的猪、死亡胎儿等，取肺、扁桃体、脾脏和淋巴结等组织；待检活猪，用注射器取血5ml。2～8℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）

2样品处理：每份样品分别处理。

2.1组织样品处理：每份组织分别从三个不同位置称取样品约3g，用手术剪剪碎混匀后，按照1:4加入PBS液于研磨器中研磨，匀浆后4℃8000×g离心2min，取上清液200µl于1.5ml灭菌离心管（自备）中。

       2.2全血样品处理：待血凝后取血清200µl，置1.5ml灭菌离心管（自备）中。

       2.3阳性对照处理：取阳性对照200µl，置1.5ml灭菌离心管（自备）中。

       2.4阴性对照处理：取阴性对照200µl，置1.5ml灭菌离心管（自备）中。

操作步骤

       1 病毒 RNA提取

       1.1 取已处理的样品、阳性对照和阴性对照，分别加入200µl试剂Ⅰ，剧烈震荡混匀，室温放置3-5min。

       1.2 加入75µl试剂Ⅱ，混合均匀后，4℃ 12000×g离心3-5 min。

       1.3 将上清液转移到新的2ml收集管中，加入300µl异丙醇，上下颠倒混匀。

    1.4 将混匀液转移至吸附柱中（提前将吸附柱安置于另一新的2ml收集管中），4℃ 12000×g离心1 min，弃滤液。注：若吸附柱中有液体残留，可重复离心1 min。

        1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中， 4℃ 12000×g离心1 min，弃滤液。

    注：请确认洗液Ⅰ中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中，4℃ 12000×g离心1 min，弃滤液。将吸附柱放回2ml收集管中,4℃ 12000×g离心1 min。注：请确认洗液Ⅱ中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.7 将吸附柱安置于新的1.5ml的离心管（自备）中，在吸附柱膜的中央处加入50µl洗脱液，室温静置3 min，4℃ 12000×g离心1 min洗脱病毒RNA。注：溶解的RNA应置于-20℃或者更低温度环境下保存。

       2 RT-PCR操作程序

   25µl体系: 使用前每份中分别加入21µl RT-PCR反应液、1µl酶混合液和3µl“1.7”中

         提取的模板RNA（注：使用时可根据情况适当稀释），混匀后按照以下程序进行PCR扩增：

50℃     30min

95℃     3min

94℃     50s

55℃     50s       35个循环

72℃     1min

72℃     10min。

   3 电泳

称2g琼脂糖于250ml锥形瓶中，加入TAE电泳缓冲液200ml，于微波炉中熔解，再加入10µl核酸染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10µl、Marker适量点样于琼脂糖凝胶孔中，以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳30min，紫外灯下观察结果。

  结果判定

阳性对照在421bp和511bp处出现扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品在421bp处出现扩增带为猪繁殖与呼吸综合征变异株病毒阳性，或在511bp处出现扩增带为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性，否则为阴性。

 附：本试剂盒A盒中附赠的TAE电泳缓冲液，使用时用双蒸水或去离子水50倍稀释后使用。